细菌的形态与结构

 

细菌(bacterium)是单细胞原核型微生物,有广义和狭义两种范畴。广义上泛指各类原核细胞型微生物,包括细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体。狭义上则专指其中数量最大、种类最多、具有典型代表性的细菌,是本章讨论的对象。它们形体微小,结构简单,具有坚韧的细胞壁和原始核质,除核糖体外无其他细胞器。了解细菌的形态和结构对基础和临床医学均有重要意义。

第一节 细菌的大小与形态

观察细菌最常用的仪器是光学显微镜,其大小一般以微米(μm)为单位。

细菌为无色半透明体,一般采用革兰染色法染色后可以清楚的观察细菌的形态,并可将细菌分为两大类,即革兰阳性菌(G+)和革兰阴性菌(G-)。细菌按其外形,主要有球菌(coccus)、杆菌(bacillus)和螺形菌(spiral bacterium)三大类,每类菌又根据其形态特征分为若干种(图1-1)。

图1-1 细菌的基本形态

不同种类的细菌形态大小不一,同一种细菌的形态受菌龄和环境因素的影响而有差异,如生长的程度、pH、培养基成分和培养时间等因素对细菌的形态影响很大。一般是细菌在适宜的生长条件下培养8~18小时时形态比较典型,在不利环境或菌龄老时常出现不规则的多形性。因此,观察细菌的大小和形态,应选择适宜生长条件下的对数期为宜。

第二节 细菌的结构

细菌虽小,仍具有一定的细胞结构(图1-2)和功能。细胞壁、细胞膜、细胞质和核质为各种细菌都有,是细菌的基本结构;荚膜、鞭毛、菌毛、芽胞仅某些细菌具有,为其特殊结构。

图1-2 细菌的结构模式图

一、 细菌的基本结构

细胞壁 细胞壁(cell wall)位于菌细胞的最外层,包绕在细胞膜的周围, 组成较复杂, 并随不同细菌而异。革兰阳性菌和革兰阴性菌细胞壁的共有组分为肽聚糖,但各自有其特殊组分。

1.肽聚糖层 肽聚糖(peptidoglycan)是细菌细胞壁中的主要组分,为原核细胞所特有,又称粘肽(mucopeptide)或胞壁质(murein)。革兰阳性菌的肽聚糖由聚糖骨架、四肽侧链和五肽交联桥三部分组成(图1-3),革兰阴性菌的肽聚糖仅由聚糖骨架和四肽侧链两部分组成(图1-4)。


图1-3 金黄色葡萄球菌细胞壁的肽聚糖结构

图1-4 大肠埃希菌细胞壁的肽聚糖结构

聚糖骨架由N-乙酰葡糖胺(N-acetyl glucosamine)和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)交替间隔排列,经β-1,4糖苷键联结而成。各种细菌细胞壁的聚糖骨架均相同。在N-乙酰胞壁酸的分子上连接着四肽侧链, 四肽侧链的组成和联结方式随菌不同而异。如金黄色葡萄球菌(革兰阳性菌)细胞壁的四肽侧链的氨基酸依次为L-丙氨酸、D-谷氨酸、L-赖氨酸和D-丙氨酸;第三位的L-赖氨酸通过由五个甘氨酸组成的交联桥连接到相邻聚糖骨架四肽侧链末端的D-丙氨酸上,从而构成机械强度十分坚韧的三维立体结构。在大肠埃希菌(革兰阴性菌)的四肽侧链中,第三位氨基酸是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP),并由DAP与相邻四肽侧链末端的D-丙氨酸直接连接,没有五肽交联桥,因而只形成单层平面网络的二维结构。

2.革兰阳性菌细胞壁特殊组分 革兰阳性菌的细胞壁较厚(20nm~80nm),除含有15~50层肽聚糖结构外,尚含有大量的磷壁酸(teichoic acid)或磷壁醛酸(teichuronic acid),约占细胞壁干重的50%(图1-5)。


图1-5 革兰阳性菌细胞壁结构模式图

磷壁酸是由核糖醇或甘油残基经磷酸二酯键互相连接而成的多聚物,其结构中少数基团被氨基酸或糖所取代,多个磷壁酸分子组成长链穿插于肽聚糖层中。按其结合部位不同,分为壁磷壁酸(wall teichoic acid)和膜磷壁酸(membrane teichoic acid)两种。前者的一端通过磷脂与肽聚糖上的胞壁酸共价结合,另端伸出细胞壁游离于菌细胞外。膜磷壁酸,或称脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA),一端与细胞膜外层上的糖脂共价结合,另端穿越肽聚糖层伸出细胞壁表面呈游离状态。磷壁醛酸是一种与磷壁酸相似的多聚体,仅其结构中以糖醛酸(如N-乙酰甘露醛酸或D-葡萄糖醛酸)代替磷酸。磷壁醛酸仅在磷酸盐供给受限的条件下合成,以代替磷壁酸。

此外,某些革兰阳性菌细胞壁表面尚有一些特殊的表面蛋白质,如金黄色葡萄球菌的A蛋白, A群链球菌的M蛋白等。

3.革兰阴性菌细胞壁特殊组分 革兰阴性菌细胞壁较薄(10nm~15nm),但结构较复杂。在1~2层肽聚糖结构外侧,尚有其特殊组分外膜(outer membrane),约占细胞壁干重的80%(图1-6)。


图1-6 革兰阴性菌细胞壁结构模式图

外膜由脂蛋白、脂质双层和脂多糖三部分组成。脂蛋白位于肽聚糖层和脂质双层之间,其蛋白质部分与肽聚糖侧链的二氨基庚二酸相连,其脂质部分与脂质双层非共价结合,使外膜和肽聚糖层构成一个整体。脂质双层的结构其内小叶组成与细胞膜的内小叶相似,而外小叶的磷脂被脂多糖分子所替代,呈不对称的膜结构。脂质双层内镶嵌着多种蛋白质称为外膜蛋白(outer membrane protein,OMP),其中有的为孔蛋白(porin),呈三聚体,如大肠埃希菌的OmpF、OmpC,允许低分子量(分子量≤600)亲水性物质被动扩散;有的为诱导性或去阻遏蛋白质,参与特殊物质的扩散过程;有的为噬菌体、性菌毛或细菌素的受体。由脂质双层向细胞外伸出的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)由脂质A、核心多糖和特异多糖三部分组成,即革兰阴性菌的内毒素(endotoxin)。

(1)脂质A(lipid A) 由β-1,6糖苷键相联的D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架,双糖骨架的游离羟基和氨基可携带多种长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属细菌的脂质A骨架基本一致,其主要差别是脂肪酸的种类和磷酸基团的取代不尽相同,其中β-羟基豆蔻酸是肠道菌所共有的。脂质A是内毒素的毒性和生物学活性的主要组分,无种属特异性,故不同细菌产生的内毒素的毒性作用均相似。

(2)核心多糖(core polysaccharide) 位于脂质A的外层,由外核心(outer core)和内核心(inner core)两部分组成。前者包括己糖(葡萄糖、半乳糖等),后者包括庚糖、2-酮基-3-脱氧辛酸(2-keto-3-deoxyoctanoic acid,KDO)、磷酸乙醇胺等。经KDO与脂质A共价联结。核心多糖有属特异性,同一属细菌的核心多糖相同。

(3)特异多糖(specific polysaccharide) 是脂多糖的最外层,由数个至数十个低聚糖(3~5个单糖)重复单位构成的多糖链。特异多糖即革兰阴性菌的菌体抗原(O抗原),具有种特异性,因其多糖中单糖的种类、位置、排列和空间构型各不相同所致。特异多糖的缺失,细菌从光滑(smooth,S)型变为粗糙(rough,R)型。

另外,少数革兰阴性菌(脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌)的LPS结构不典型,其外膜糖脂含有短链分枝状聚糖组分(与粗糙型肠道菌的LPS相似),称为脂寡糖(lipooligosaccharide,LOS)。它与哺乳动物细胞膜的鞘糖脂成分非常相似,从而使这些细菌逃避宿主免疫细胞的识别。LOS作为重要的毒力因子受到关注。

在革兰阴性菌的细胞膜和外膜的脂质双层之间有一空隙,约占细胞体积的20%~40%,称为周浆间隙(periplasmic space)。该间隙含有多种蛋白酶、核酸酶、解毒酶(如β-内酰胺酶,氨基糖甙类抗生素钝化酶)及特殊结合蛋白,在细菌获得营养、解除有害物质毒性等方面有重要作用。

革兰阳性菌和阴性菌细胞壁结构显著不同,导致这两类细菌在染色性、抗原性、致病性及对药物的敏感性等方面有很大差异。

4.细胞壁的功能 细菌细胞壁坚韧而富弹性,其主要功能是维持菌体固有的形态,并保护细菌抵抗低渗环境。细菌细胞质内有高浓度的无机盐和大分子营养物质,其渗透压高达5~25个大气压。由于细胞壁的保护作用,使细菌能承受内部巨大的渗透压而不会破裂,并能在相对低渗的环境下生存。细胞壁上有许多小孔,参与菌体内外的物质交换。 菌体表面带有多种抗原表位,可以诱发机体的免疫应答。

革兰阳性菌的磷壁酸是重要表面抗原,与血清型分类有关。它带有较多的负电荷,能与Mg2+等双价离子结合,有助于维持菌体内离子的平衡。磷壁酸还可起到稳定和加强细胞壁的作用。乙型溶血性链球菌表面的M蛋白与LTA结合在细菌表面形成微纤维(microfibrils),后者介导菌体与宿主细胞的粘附,是其致病因子之一。

革兰阴性菌的外膜是一种有效的屏障结构,使细菌不易受到机体的体液杀菌物质、肠道的胆盐及消化酶等的作用;还可阻止某些抗生素的进入,成为细菌耐药的机制之一。LPS(内毒素)是革兰阴性菌重要的致病物质,使机体发热,白细胞增多,直至休克死亡。另一方面LPS也可增强机体非特异性抵抗力,并有抗肿瘤等有益作用。

5.细菌细胞壁缺陷型(细菌L型) 细菌细胞壁的肽聚糖结构受到理化或生物因素的直接破坏或合成被抑制,这种细胞壁受损的细菌一般在普通环境中不能耐受菌体内的高渗透压而胀裂死亡。但在高渗环境下,它们仍可存活。 革兰阳性菌细胞壁缺失后, 原生质仅被一层细胞膜包住,称为原生质体(protoplast);革兰阴性菌肽聚糖层受损后尚有外膜保护,称为原生质球(spheroplast)。这种细胞壁受损的细菌能够生长和分裂者称为细菌细胞壁缺陷型或细菌L型(L form), 因其1935年首先在Lister研究院发现而得名。
细菌L型在体内或体外、人工诱导或自然情况下均可形成,诱发因素很多,如溶菌酶(lysozyme)、溶葡萄球菌素(lysostaphin)、青霉素、胆汁、抗体、补体等。其中溶菌酶和溶葡萄球菌素能裂解肽聚糖中N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1,4糖苷键,破坏聚糖骨架。青霉素能与细菌竞争合成肽聚糖过程中所需的转肽酶, 抑制四肽侧链上D-丙氨酸与五肽桥之间的联结,使细菌不能合成完整的肽聚糖。人与动物细胞无细胞壁,也无肽聚糖结构,故溶菌酶和青霉素对人体细胞无破坏作用。

细菌L型的形态因缺失细胞壁呈高度多形性,大小不一,有球形、杆状和丝状等。着色不匀,无论其原为革兰阳性或阴性菌,形成L型大多染成革兰阴性。细菌L型难以培养,其营养要求基本与原菌相似,但需在高渗低琼脂含血清的培养基中生长。细菌L型生长繁殖较原菌缓慢,一般培养2~7天后在软琼脂平板上形成中间较厚、四周较薄的荷包蛋样细小菌落,也有的长成颗粒状或丝状菌落。L型在液体培养基中生长后呈较疏松的絮状颗粒,沉于管底,培养液则澄清。去除诱发因素后,有些L型可回复为原菌,有些则不能回复,其决定因素为L型是否含有残存的肽聚糖作为自身再合成的引物。

某些L型仍有一定的致病力,通常引起慢性感染,如尿路感染、骨髓炎、心内膜炎等,并常在使用作用于细胞壁的抗菌药物(β-内酰胺类抗生素等)治疗过程中发生。临床上遇有症状明显而标本常规细菌培养阴性者,应考虑细菌L型感染的可能性,宜作L型的专门分离培养,并更换抗菌药物。

细胞膜(cell membrane) 又称为胞浆膜(cytoplasmic membrane)或内膜(inner membrane),位于细胞壁内侧,紧包着细胞质。厚约5nm~10nm,柔韧致密,富有弹性,占细胞干重的10%~30%。细菌细胞膜的结构为典型的“单位膜”,与真核细胞基本相同,由磷脂和多种蛋白质组成,但不含胆固醇。

细菌细胞膜是细菌赖以生存的重要结构之一,其功能也与真核细胞类似,主要有物质转运、生物合成、呼吸和分泌等作用。
细菌的细胞膜形成疏水性屏障,允许水和某些小分子物质被动性扩散,特异性营养物质的选择性进入和废物的排出,及透性酶参与营养物质的主动摄取过程。细胞膜还含有多种酶类,诸如细胞色素和组成呼吸链的其它酶类,三羧酸循环的某些酶,及参与细胞结构(如肽聚糖、鞭毛和荚膜等)合成的一些酶,参与菌细胞的呼吸、能量代谢和生物合成等重要的生命活动。据此,认为细菌细胞膜的功能与真核细胞的线粒体膜相似。

细菌分泌水解酶和致病蛋白质,在革兰阳性菌直接分泌到外环境中;在革兰阴性菌则较为复杂,现已有4个分泌系统参与合成蛋白质的分泌过程,由多种细胞膜蛋白、外膜蛋白和辅助蛋白(信号肽酶和伴侣蛋白等)组成,分别称为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统(图1-7)。


图1-7 革兰阴性菌Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统模式图

Ⅰ型:大肠埃希菌?-溶血素(?-hemolysin)的分泌;Ⅱ型:克雷伯菌支链淀粉酶(pullulanase)的分泌;Ⅲ型:耶尔森菌外部蛋白质(Yersinia out protein,Yop)的分泌。

经革兰阴性菌Ⅱ型和Ⅳ型分泌系统分泌的蛋白质首先以其氨基端带有信号序列(signal sequence)的前体蛋白(preprotein)形式出现,经sec途径运输越过细胞膜进入周浆间隙。大肠埃希菌的sec途径由细胞膜蛋白(SecD~SecF、SecY)、细胞膜结合的ATPase(SecA)和伴侣蛋白(SecB)组成。在运输过程中,由细胞膜结合的信号肽酶(LspA)将前体蛋白的信号序列切割后,成熟蛋白质释放到周浆间隙。此后,Ⅱ型和Ⅳ型分泌系统运送蛋白质越过外膜的机制有所不同,前者需要多聚外膜蛋白组分(PulD)的参与,后者需要外膜分泌蛋白(autotransporter)的帮助。革兰阴性菌的胞外降解酶的分泌主要是通过II型分泌系统,淋病奈瑟菌的IgA蛋白酶和幽门螺杆菌的空泡形成细胞毒素(vacuolating cytotoxin)的分泌由Ⅳ型系统完成。Ⅰ型和Ⅲ型分泌系统不依赖于sec途径。大肠埃希菌α-溶血素是经过Ⅰ型系统分泌,该系统需要三种蛋白质参与,即细胞膜ATPase(HlyB)、外膜蛋白(TolC)和膜融合蛋白(HlyD)。Ⅰ型系统分泌蛋白的羧基端有60个氨基酸作为信号肽。Ⅲ型分泌系统由20余种蛋白质组成,包括细胞膜蛋白、ATPase(YscN)、伴侣蛋白(Syc)和多聚外膜蛋白(YscC)。经Ⅲ型系统分泌的蛋白质的分泌信号位于其编码序列mRNA 5’端。编码Ⅲ型分泌系统的DNA常常位于细菌染色体上致病岛的区域内,是细菌分泌致病蛋白质的主要途径。该系统较为复杂,可能涉及致病蛋白质进入宿主细胞内的致病过程。

细胞质(cytoplasm) 细胞膜包裹的溶胶状物质为细胞质或称原生质(protoplasm),由水、蛋白质、脂类、核酸及少量糖和无机盐组成,其中含有许多重要结构。

1.核糖体(ribosome) 核糖体是细菌合成蛋白质的场所,游离存在于细胞质中,每个细菌体内可达数万个。细菌核糖体沉降系数为70S,由50S和30S两个亚基组成。以大肠埃希菌为例,其化学组成66%是RNA(包括23S、16S和5S rRNA),34%为蛋白质。核糖体常与正在转录的mRNA相连呈“串珠”状,称多聚核糖体,使转录和翻译偶联在一起。

真核生物的核糖体与细菌不同,有些抗生素如链霉素或红霉素能分别与细菌核糖体的30S亚基或50S亚基结合,干扰其蛋白质合成,从而杀死细菌;但这些药物对人类的核糖体则无作用。

2.质粒(plasmid) 质粒是染色体外的遗传物质,存在于细胞质中。 为闭合环状的双链DNA,带有遗传信息,控制细菌某些特定的遗传性状。质粒能独立自行复制,随细菌分裂转移到子代细胞中。质粒不是细菌生长所必不可少的,失去质粒的细菌仍能正常存活。质粒除决定该菌自身的某种性状外,还可通过接合或转导作用等将有关性状传递给另一细菌。质粒编码的细菌性状有菌毛、细菌素、毒素和耐药性的产生等。

3.胞质颗粒 细菌细胞质中含有多种颗粒,大多为贮藏的营养物质,包括糖原、淀粉等多糖、脂类、磷酸盐等。胞质颗粒又称为内含物(inclusion),不是细菌的恒定结构,不同菌有不同的胞质颗粒,同一菌在不同环境或生长期亦可不同。当营养充足时,胞质颗粒较多;养料和能源短缺时,动用贮备,颗粒减少甚至消失。异染颗粒(metachromatic granule)是胞质颗粒的一种,含RNA和多偏磷酸盐,嗜碱性强,亚甲蓝染色呈紫色,常见于白喉棒状杆菌,位于菌体两端,故又称极体(polar body),有助于鉴定。

4.中介体(mesosome) 中介体是部分细胞膜内陷、折叠、卷曲形成的囊状物,多见于革兰阳性细菌(图1-8)。中介体常位于菌体侧面或靠近中部,可有一个或多个。中介体一端连在细胞膜上,另一端与核质相连,细胞分裂时中介体亦一分为二,各携一套核质进入子代细胞。中介体的形成,有效地扩大了细胞膜面积,相应地增加了酶的含量和能量的产生,其功能类似于真核细胞的线粒体,故亦称为拟线粒体(chondroid)。


图1-8 细菌中介体模式图

核质(nuclear material) 细菌是原核细胞,不具有成形的核。细菌的遗传物质称为核质或拟核(nucleoid),集中于细胞质的某一区域,多在菌体中央,无核膜、核仁和有丝分裂器;因其功能与真核细胞的染色体相似,故习惯上亦称之为细菌的染色体(chromosome)。

细菌核质为单倍体,细胞分裂时可有完全相同的多拷贝。核质由单一密闭环状DNA分子反复回旋卷曲盘绕组成松散网状结构。在电镜支持膜上直接温和裂菌观察, 显示有类似于真核细胞染色质的串珠样结构。核质的化学组成除DNA外,还有小量的RNA(以RNA多聚酶形式)和组蛋白样的蛋白质(histone-like proteins)。细菌经RNA酶或酸将RNA水解,再用Feulgen法染色,光学显微镜下可看到着染的核质,形态多呈球形、棒状或哑铃状。大肠埃希菌的核质分子量约3×109,伸展后长度可达1.1mm,含4639kb,可以有3000~5000个基因。

细菌的染色体与真核细胞染色体相比, 有两个显著的不同: 一是前者的DNA量要小得多, 其序列的排列也就简单得多。 二是除了RNA基因通常是多拷贝, 以便装备大量的核糖体满足细菌的迅速生长繁殖外, 细菌绝大多数的蛋白质基因保持单拷贝形式,很少有重复序列。

二、细菌的特殊结构

荚膜(capsule) 某些细菌在其细胞壁外包绕一层粘液性物质,为多糖或多肽的多聚体,用理化方法去除后并不影响菌细胞的生命活动。将粘液性物质牢固地与细胞壁结合,厚度≥0.2μm ,边界明显者均称为荚膜(图1-2);厚度<0.2μm者称为微荚膜(microcapsule),伤寒沙门菌的Vi抗原,以及大肠埃希菌的K抗原等属之。若粘液性物质疏松地附着于菌细胞表面,边界不明显且易被洗脱者称为粘液层(slime layer)。介于荚膜和粘液层之间的结构称为糖萼或糖被(glycocalyx),由多糖组成,是从菌体伸出的纤维构成疏松网状结构。某些细菌在体内外附着于宿主细胞表面或无生命物体表面,通过荚膜多糖或糖萼使细菌相互粘连形成的结构群体(structured community)称为生物膜(biofilm)。

1.荚膜的化学组成 大多数细菌的荚膜是多糖,炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌等少数菌的荚膜为多肽。荚膜多糖为高度水合分子,含水量95%以上,与菌细胞表面的磷脂或脂质A共价结合。多糖分子组成和构型的多样化使其结构极为复杂,成为血清学分型的基础。例如肺炎链球菌的荚膜多糖物质的抗原至少可分成85个血清型。荚膜与同型抗血清结合发生反应后即逐渐增大,出现荚膜肿胀反应,可藉此将细菌分型。

荚膜的形成需要能量,与环境条件有密切关系。一般在动物体内或含有血清或糖的培养基中容易形成荚膜,在普通培养基上或连续传代则易消失。有荚膜的细菌在固体培养基上形成粘液(M)型或光滑(S)型菌落,失去荚膜后其菌落变为粗糙(R)型。

荚膜对一般碱性染料亲和力低,不易着色,普通染色只能见到菌体周围有未着色的透明圈。如用墨汁作负染色,则荚膜显现更为清楚。用特殊染色法可将荚膜染成与菌体不同的颜色。

2.荚膜的功能 荚膜和微荚膜具有相同的功能。

(1)抗吞噬作用:荚膜具有抵抗宿主吞噬细胞的作用,因而荚膜是病原菌的重要毒力因子。例如肺炎链球菌,有荚膜株数个菌就可使实验小鼠致死,无荚膜株则高达上亿个菌才能使小鼠死亡。

吞噬现象有两种类型,一为表面吞噬,另一为调理素介导的吞噬。表面吞噬是吞噬细胞直接摄取细菌等颗粒性异物,被吞菌并不被IgG抗体和活化的补体组分C3b包被。这种吞噬的强弱与被吞颗粒表面的理化性质关系极大。颗粒表面的疏水性与表面吞噬的强度密切相关,菌体表面越疏水,细菌抗吞噬作用越差。荚膜多糖亲水且带负电荷,故能阻滞表面吞噬活性。由调理素介导的吞噬,其吞噬效率大大超过表面吞噬。荚膜在菌细胞表面的空间占位和屏障作用,阻止补体组分C3b的沉积,并遮蔽了细菌激活补体旁路途径的表面结构,从而抵抗补体介导的杀伤作用。

(2)粘附作用:荚膜多糖或糖萼可使细菌彼此之间粘连,也可粘附于组织细胞或无生命物体表面形成生物膜,导致生物材料(如人工心脏瓣膜、伤口引流管等)相关感染性疾病或慢性感染的反复发作。生物膜菌株在住院病人的各种导管内粘附定居,是院内感染发生的重要因素。此外,包被有生物膜的细菌对抗生素的敏感性大大降低。变异链球菌(Streptococcus mutans)依靠糖萼将其本身和其他细菌粘附在牙齿表面,形成菌斑。然后,菌斑内的细菌利用口腔中的蔗糖产生大量的乳酸,积聚在附着部位,导致牙齿珐琅质的破坏,形成龋齿。

(3)抗有害物质的损伤作用:荚膜处于菌细胞的最外层,有保护菌体避免和减少受溶菌酶、补体、抗菌抗体、抗菌药物等有害物质的损伤作用。

鞭毛(flagellum) 许多细菌,包括所有的弧菌和螺菌,约半数的杆菌和个别球菌,在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状物,少仅1~2根,多者达数百。这些丝状物称为鞭毛,是细菌的运动器官。鞭毛长5μm~20μm,直径12nm~30nm,需用电子显微镜观察,或经特殊染色法使鞭毛增粗后才能在普通光学显微镜下看到(图1-9)。


图1-9 鞭毛(变形杆菌)
鞭毛染色 ×1000

根据鞭毛的数量和部位,可将鞭毛菌分成4类(图1-10):①单毛菌(monotrichate):只有一根鞭毛,位于菌体一端,如霍乱弧菌;②双毛菌(amphitrichate):菌体两端各有一根鞭毛,如空肠弯曲菌;③丛毛菌(lophotrichate):菌体一端或两端有一丛鞭毛,如铜绿假单胞菌;④周毛菌(peritrichate):菌体周身遍布许多鞭毛,如伤寒沙门菌。


图1-10 细菌鞭毛的类型

1.鞭毛的结构 鞭毛自细胞膜长出,游离于菌细胞外,由基础小体、钩状体和丝状体三个部分组成(图1-11)。

图1-11 大肠埃希菌鞭毛结构模式图
 

(1)基础小体(basal body):位于鞭毛根部,嵌在细胞壁和细胞膜中。革兰阴性菌鞭毛的基础小体由一根圆柱、两对同心环和输出装置组成。其中,一对是M环和S环,附着在细胞膜上;另一对是P环和L环,附着在细胞壁的肽聚糖和外膜的脂多糖上。基础小体的基底部是鞭毛的输出装置,位于细胞膜内面的细胞质内。 基底部圆柱体周围的发动器为鞭毛运动提供能量, 近旁的开关决定鞭毛转动的方向。革兰阳性菌的细胞壁无外膜,其鞭毛只有M、S一对同心环。

(2)钩状体(hook):位于鞭毛伸出菌体之处,呈约90°的钩状弯曲。鞭毛由此转弯向外伸出,成为丝状体。

(3)丝状体(filament):呈纤丝状,伸出于菌体外,由鞭毛蛋白(flagellin)紧密排列并缠绕而成的中空管状结构。丝状体的作用犹如船舶或飞机的螺旋桨推进器。鞭毛蛋白是一种弹力纤维蛋白,其氨基酸组成与骨骼肌中的肌动蛋白相似,可能与鞭毛的运动有关。

细菌是由鞭毛发动器将跨膜质子梯度中贮存的化学能转变为鞭毛转动所需的能量,周浆间隙中的质子(H+)通过鞭毛发动器流入细胞质内。有少数细菌能利用钠离子梯度供给鞭毛转动的能量。在这个过程中,由跨膜质子梯度或钠离子梯度构成质子动力(proton motive force)。鞭毛发动器能够顺时针或逆时针方向转动,从而决定细菌游动的方向。当发动器逆时针方向转动时,鞭毛的丝状体结合成一束拖在菌体后,推动细菌向前进;若发动器呈顺时针方向转动,束状丝状体松开,细菌停顿或向相反方向游动。平时,细菌以这两种方式交替游动,称为随意移动。

鞭毛是从尖端生长,在菌体内形成的鞭毛蛋白分子不断地添加到鞭毛的末端。若用机械方法去除鞭毛,新的鞭毛很快合成,3~6分钟内恢复动力。各菌种的鞭毛蛋白结构不同,具有高度的抗原性,称为鞭毛(H)抗原。

2.鞭毛的功能 具有鞭毛的细菌在液体环境中能自由游动,细菌的运动有化学趋向性,常向营养物质处前进,而逃离有害物质。

有些细菌的鞭毛与致病性有关。例如霍乱弧菌、空肠弯曲菌等通过活泼的鞭毛运动穿透小肠粘膜表面覆盖的粘液层,使菌体粘附于肠粘膜上皮细胞,产生毒性物质导致病变的发生。

根据有鞭毛菌的动力和鞭毛的抗原性,可用以鉴定细菌和进行细菌分类。

菌毛(pilus或fimbriae) 许多革兰阴性菌和少数革兰阳性菌菌体表面存在着一种比鞭毛更细、更短而直硬的丝状物,与细菌的运动无关,称为菌毛。菌毛由结构蛋白亚单位菌毛蛋白(pilin)组成,呈螺旋状排列成圆柱体,新形成的菌毛蛋白分子插入菌毛的基底部。菌毛蛋白具有抗原性,其编码基因位于细菌的染色体或质粒上。菌毛在普通光学显微镜下看不到,必须用电子显微镜观察(图1-12)。


图1-12 大肠埃希菌的菌毛
透射电镜 ×20000

根据功能不同,菌毛可分为普通菌毛和性菌毛两类。

1.普通菌毛(ordinary pilus) 长0.2μm~2μm,直径3nm ~8nm。遍布菌细胞表面,每菌可达数百根。这类菌毛是细菌的粘附结构,能与宿主细胞表面的特异性受体结合,是细菌感染的第一步。因此,菌毛和细菌的致病性密切相关。菌毛的受体常为糖蛋白或糖脂,与菌毛结合的特异性决定了宿主感染的易感部位。同样,如果红细胞表面具有菌毛受体的相似成分,不同的菌毛就会引起不同类型的红细胞凝集,称此为血凝(hemagglutination,HA),藉此可以鉴定菌毛。例如大肠埃希菌的Ⅰ型菌毛(type I 或common pili),粘附于肠道和下尿道粘膜上皮细胞表面;能凝集豚鼠红细胞,可被D-甘露糖所抑制,称为甘露糖敏感性血凝(mannitol sensitive hemagglutination,MSHA)。致肾盂肾炎大肠埃希菌(pyelonephritic E. coli 或uropathogenic E. coli,UPEC)的P菌毛(pyelonephritis -associated pili,P pili)常粘附于肾脏的集合管和肾盏,能凝集P血型阳性红细胞,且不被甘露糖所抑制,称为甘露糖抗性血凝(mannitol resistant hemagglutination,MRHA),是上行性尿路感染的重要致病菌。肠产毒型大肠埃希菌(enterotoxigenic E. coli,ETEC)的定植因子是一种特殊类型的菌毛(CFA/I, CFA/Ⅱ),粘附于小肠粘膜细胞,编码定植因子和肠毒素的基因均位于可接合传递质粒上,是该菌重要的毒力因子。霍乱弧菌、肠致病型大肠埃希菌(EPEC)和淋病奈瑟菌的菌毛都属于Ⅳ型菌毛,在所致的肠道或泌尿生殖道感染中起到关键作用。有菌毛菌株的粘附可抵抗肠蠕动或尿液的冲洗作用而有利于定居,一旦丧失菌毛,其致病力亦随之消失。

2.性菌毛(sex pilus) 仅见于少数革兰阴性菌。数量少,一个菌只有1~4根。比普通菌毛长而粗,中空呈管状。性菌毛由F质粒编码,故性菌毛又称F菌毛。带有性菌毛的细菌称为F+菌或雄性菌,无性菌毛者称为F-菌或雌性菌。当F+菌与F-菌相遇时,F+菌的性菌毛与F-菌相应的性菌毛受体结合,F+菌体内的质粒或染色体DNA可通过中空的性菌毛进入F-菌体内,这个过程称为接合(conjugation)。细菌编码毒力和耐药性等性状的遗传物质也可通过此方式传递。此外,性菌毛也是某些噬菌体吸附于菌细胞的受体。

芽胞(spore) 某些细菌在一定的环境条件下,能在菌体内部形成一个圆形或卵圆形小体,是细菌的休眠形式,称为内芽胞(endospore),简称芽胞。产生芽胞的细菌都是革兰阳性菌,重要的有芽胞杆菌属(炭疽芽胞杆菌等)和梭菌属(破伤风梭菌等)。

1.芽胞的形成与发芽 细菌形成芽胞的能力是由菌体内的芽胞基因决定的。芽胞一般只是在动物体外才能形成,其形成条件因菌种而异。

芽胞带有完整的核质、酶系统和合成菌体组分的结构,能保存细菌的全部生命必需物质。芽胞形成后,菌体即成为空壳,有些芽胞可从菌体脱落游离。

芽胞折光性强,壁厚,不易着色。染色时需经媒染、加热等处理。芽胞的大小、形状、位置等随菌种而异,有重要的鉴别价值(图 1-13)。例如炭疽芽胞杆菌的芽胞为卵圆形、比菌体小,位于菌体中央;破伤风梭菌芽胞正圆形,比菌体大,位于顶端,状如鼓锤;肉毒梭菌芽胞亦比菌体大,位于次极端。


图1-13 细菌芽胞的形态

 

成熟的芽胞具有多层膜结构(图1-14)。芽胞核心是芽胞的原生质体,含有细菌原有的核质和核糖体、酶类等主要生命基质。核心的外层依次为内膜、芽胞壁、皮质、外膜、芽胞壳和芽胞外衣,将其层层包裹,成为坚实的球体。内膜和外膜由原来的细胞膜形成。芽胞壁含肽聚糖,发芽后成为细菌的细胞壁。皮质是芽胞包膜中最厚的一层,由一种特殊的肽聚糖组成。芽胞壳是一种类似角蛋白的疏水性蛋白质,致密无通透性,能抗化学药物进入,并增强对紫外线照射的抵抗力。有些细菌芽胞还有一层疏松的芽胞外衣,含有脂蛋白和糖类。

 


图1-14 细菌芽胞的结构

 

芽胞形成后,若由于机械力、热、pH改变等刺激作用下,破坏其芽胞壳,并供给水分和营养,芽胞可发芽,形成新的菌体。

一个细菌只形成一个芽胞,一个芽胞发芽也只生成一个菌体,细菌数量并未增加,因而芽胞不是细菌的繁殖方式。与芽胞相比,未形成芽胞而具有繁殖能力的菌体可称为繁殖体(vegetative form)。

细菌的芽胞发芽(germination)成繁殖体的过程,可分为活化、启动和长出三个连续阶段。整个过程大约需要90分钟。热刺激(如60℃1小时或85℃5分钟)、pH值降低和含硫氢基化合物均可活化芽胞发芽。芽胞壳经活化后,其富含二硫键的蛋白构型变化,引起渗透性改变,致使阳离子渗入,细胞膜脂质活性增强,并启动电子传递链。同时,随着水分渗入,芽胞特有成分吡啶二羧酸钙、皮质肽聚糖和芽胞壳物质等大量降解,使芽胞通透性加强,耐热、抗辐射等特性消失。由于代谢活性和呼吸增强,生物合成加速,顺序为RNA、蛋白质、脂质,最后是DNA。继而芽胞核心体积增大、皮质膨松、芽胞壳破裂,芽管长出并逐渐长大、发育成新的繁殖体细胞。
2.芽胞的功能 细菌的芽胞对热力、干燥、辐射、化学消毒剂等理化因素均有强大的抵抗力。一般细菌繁殖体在80℃水中迅速死亡,而有的细菌芽胞可耐100℃沸水数小时。被炭疽芽胞杆菌芽胞污染的草原,传染性可保持20~30年。

细菌芽胞并不直接引起疾病,仅当发芽成为繁殖体后,就能迅速大量繁殖而致病。例如土壤中常有破伤风梭菌的芽胞,一旦外伤深部创口被泥土污染,进入伤口的芽胞在适宜条件下即可发芽成繁殖体再致病。

被芽胞污染的用具、敷料、手术器械等,用一般方法不易将其杀死,杀灭芽胞最可靠的方法是高压蒸气灭菌。当进行消毒灭菌时,应以芽胞(枯草芽胞杆菌黑色变种)是否被杀死作为判断灭菌效果的指标。

细菌芽胞抵抗力强的原因,可能与下列因素有关:①芽胞含水量少,约占繁殖体的40%,蛋白质受热后不易变性;②芽胞具有多层致密的厚膜,理化因素不易透入;②芽胞的核心和皮质中含有一种特有的化学组分吡啶二羧酸(dipicolinic acid,DPA),DPA与钙结合生成的盐能提高芽胞中各种酶的热稳定性。芽胞形成过程中很快合成DPA,同时也获得耐热性;芽胞发芽时,DPA从芽胞内渗出,其耐热性亦随之丧失。

第三节 细菌形态检查法

显微镜放大法 细菌形体微小,肉眼不能直接看到,必须藉助显微镜放大后才能看到。

1.普通光学显微镜 普通光学显微镜(light microscope)以可见光(日光或灯光)为光源,波长0.4μm~0.7μm,平均约0.5μm。其分辨率为光波波长的一半,即0.25μm。一般细菌都大于0.25μm,故可用普通光学显微镜观察。

2.电子显微镜 电子显微镜(electron microscope)是利用电子流代替可见光波,以电磁圈代替放大透镜。电子波长极短,约为0.005nm,其放大倍数可达数十万倍,能分辨1nm 的微粒。不仅能看清细菌的外形,内部超微结构也可一览无遗。电子显微镜显示的形象,可投射到荧光屏上,也可照相拍摄。当前使用的电子显微镜有两类,即透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)和扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)。SEM的分辨率一般较TEM低,但可清楚地显露观察物体的三维立体图像。配合电子显微镜观察使用的标本制备方法有用磷钨酸或钼酸铵作负染色、投影法(shadowing)、超薄切片(ultrathin section)、冰冻蚀刻法(freeze etching)等。电子显微镜标本须在真空干燥的状态下检查,故不能观察活的微生物。

此外,尚有暗视野显微镜(darkfield microscope)、相差显微镜(phase contrast microscope)、荧光显微镜(fluorescence microscope)和共聚焦显微镜(cofocal microscope)等,适用于观察不同情况下的细菌形态和(或)结构。

染色法 细菌体小半透明,经染色后才能观察较清楚。染色法是染色剂与细菌细胞质的结合。最常用的染色剂是盐类。 其中,碱性染色剂(basic stain)由有色的阳离子和无色的阴离子组成,酸性染色剂(acidic stain)则相反。菌细胞富含核酸,可以与带正电荷的碱性染色剂结合;酸性染色剂不能使细菌着色,而使背景着色形成反差,故称为负染(negative staining)。

染色法有多种,最常用最重要的分类鉴别染色法是革兰染色法(Gram stain)。该法是丹麦组织学家革兰(Hans Christian Gram)于1884年试图用感染的组织进行细菌染色时创建的,至今仍在广泛应用。标本固定后,先用碱性染料结晶紫初染,再加碘液媒染,使之生成结晶紫—碘复合物;此时不同细菌均被染成深紫色。然后用95%乙醇处理,有些细菌被脱色,有些不能。最后用稀释复红或沙黄复染。此法可将细菌分为两大类:不被乙醇脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌,被乙醇脱色后复染成红色者为革兰阴性菌。革兰染色法在鉴别细菌、选择抗菌药物、研究细菌致病性等方面都具有极其重要的意义。

革兰染色法的原理尚未完全阐明。但与菌细胞壁结构密切相关,如果在结晶紫—碘染之后,乙醇脱色之前去除革兰阳性菌的细胞壁,革兰阳性菌细胞就能够被脱色。目前,对革兰阳性和革兰阴性菌细胞壁的化学组分已十分清楚,但对革兰阳性菌细胞壁阻止染料被溶出的原因尚不清楚。

细菌染色法中尚有单染色法、抗酸染色法、以及荚膜、芽胞、鞭毛、细胞壁、核质等特殊染色法。


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